在其焦點上有一個帶有針孔的擋板,小孔就位于焦點處,擋板后面是一個光電倍增管。可以想像,探測光焦點前后的反射光通過這一套共焦系統,必不能聚焦到小孔上,會被擋板擋住。于是共聚焦顯微鏡系統的就是焦點處的反射光強度,通過共聚焦顯微鏡系統可以對一個半透明的物體進行三維掃描。共聚焦顯微鏡能提供無比的三維成像,以及對亞細胞結構和動力學過程的測試。使用紫外或可見光激發熒光探針,從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像,膜電位等生理信號及細胞形態的變化。
共聚焦顯微鏡系統可以迅速在計算機監視器屏幕上形成熒光圖像,照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的,焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發射針孔,焦平面以外的點不會在探測針孔處成像,這樣得到的共聚焦圖像是標本的光學橫斷面,克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點。可以全部通過針孔被探測器接收。而在共聚焦顯微鏡系統的焦平面上下位置發出的光在針孔處會產生直徑很大的光斑,對比針孔的直徑大小,則只有極少部分的光可以透過針孔被探測器接收。而且隨著距離物鏡焦平面的距離越大,樣品所產生的雜散光在針孔處的彌散斑就越大,能透過針孔的能量就越少。